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L’ADN ou le secret de la vie

SVT / 2de - 1re S

Par Valérie Oliveira, professeure de SVT

DOCUMENTS

Découverte d’un « facteur transformant »

DOC A Les expériences de Griffith en 1928

Pleins feux sur l’ADN

DOC B Les expériences d’Avery en 1944

Les bactériophages, outils fondamentaux de recherche

DOC C Les expériences d’Hershey et Chase en 1952

Des photographies révélatrices

DOC D Découverte de la structure en double hélice de l’ADN

ANALYSES DES DOCUMENTS

Bref préambule historique

Le choix de l’organisme sur lequel les expériences furent réalisées a été crucial. En effet, les scientifiques ont travaillé sur des bactéries et virus dont on sait actuellement que le bagage génétique est plus simple que celui des cellules humaines, des cellules de grenouille ou même des pois de Mendel.

Dans un article intitulé « Recherches sur les hybrides des plantes », publié en 1865, le botaniste autrichien Gregor Mendel (1822-1884) montre que des « facteurs » sont transmis de génération en génération et déterminent les caractères héréditaires. Dans sa deuxième loi de l’hérédité (« loi de pureté des gamètes »), il explique que ces facteurs sont indépendants et appariés dans la cellule, mais qu’ils se séparent lors de la formation des gamètes ; les cellules sexuelles ne contiennent donc qu’un seul exemplaire de chaque paire (il y a égalité entre apports paternel et maternel). La première loi est la « loi d’uniformité des hybrides de première génération » (rejet de l’idée d’hérédité par mélange, car la F1 est homogène pour un caractère donné lorsque les parents sont de souche pure) ; la deuxième est la « loi de pureté des gamètes » (chaque gamète ne contient qu’un seul facteur) ; la troisième est la loi de la ségrégation indépendante des caractères héréditaires.

Ce n’est qu’en 1966 que les lois de Mendel furent redécouvertes et qu’il fut reconnu comme le père fondateur de la génétique.

Au départ, les scientifiques pensaient que ces facteurs étaient des protéines. En 1903, l’Américain Walter Sutton constate le parallélisme entre le comportement des facteurs mendéliens et celui des chromosomes lors de la formation des cellules sexuelles. Il en conclut qu’il existe une relation entre ces facteurs et les chromosomes (remarque : Édouard-Gérard Balbiani – 1823-1899 – fut le premier à observer des chromosomes vers 1880). En 1909, le Danois Wilhelm Johannsen donne le nom de gènes à ces facteurs. Cependant, leur nature physico-chimique reste à découvrir.

Découverte d’un « facteur transformant »

En 1928, l’Anglais Fred Griffith (1877-1941) travaille sur la transformation bactérienne et apporte la première pierre à la découverte du support de l’hérédité. Il utilise deux souches de pneumocoques (Streptococcus pneumoniæ), qui diffèrent par leur aspect en culture : les souches R (rough, « rugueuses »), qui sont virulentes (elles sont à l’origine de la pneumonie chez les mammifères), et les souches S (smooth, « lisses »), qui ne sont pas pathogènes pour la souris. Cette différence est due au fait que les bactéries S sont entourées d’une capsule constituée d’un polysaccharide.

Griffith montre que cette caractéristique phénotypique des bactéries est héréditaire, puisqu’une bactérie se divise en donnant deux bactéries identiques à elle-même.

Expérience 1
L’injection de bactéries S vivantes à une souris conduit à la mort de celle-ci. Nous en déduisons que la souche S est à l’origine de cette mort et que ces bactéries sont donc virulentes.

Expérience 2
La souris est vivante après l’injection de bactéries R vivantes. Nous en déduisons que la souche R n’est pas mortelle pour la souris.

Mise en relation des informations apportées par les expériences 1 et 2
Il y a donc deux souches de bactéries, R et S, dont l’une est mortelle pour la souris. Or, nous savons que les deux souches diffèrent, notamment par la présence d’une capsule chez la souche S.

Problème : la capsule est-elle à l’origine de la pathogénicité de la bactérie ?
Hypothèse : la capsule est à l’origine de la mort de la souris.
Conséquence vérifiable : si l’hypothèse est juste, alors les bactéries mortes mais conservant leur capsule polysaccharidique sont virulentes pour la souris.

Expérience 3
Les bactéries S tuées par la chaleur, puis injectées à la souris, ne provoquent pas la mort de celle-ci. Nous en déduisons que la capsule n’est pas à l’origine de la mort du mammifère.

Expérience 4
Nous savons que ni les bactéries S mortes seules, ni les bactéries R seules ne sont virulentes. Or, nous constatons que, lorsque les bactéries R sont en contact avec des bactéries S tuées par la chaleur, elles provoquent une pneumonie mortelle chez la souris. Les bactéries R deviennent donc virulentes au contact des bactéries S mortes. Cela signifie que les premières ont récupéré, à partir des secondes, un « facteur » responsable de la virulence.

Problème : ce « facteur transformant » est-il héréditaire ?
Hypothèse : le caractère pathogène acquis est héréditaire.
Conséquence vérifiable : si l’hypothèse est juste, alors les bactéries R transformées seront pathogènes de génération en génération.

Expérience 5
Griffith récupère des bactéries R transformées dans le sang d’une souris tuée lors de l’expérience 4, puis les cultive (culture qui donnera, de génération en génération, des bactéries possédant une capsule) et les injecte à une autre souris. Nous constatons que les bactéries issues de celles qui ont été transformées provoquent la mort par septicémie de la deuxième souris. Le caractère acquis est donc héréditaire, et l’agent responsable de la mort des bactéries n’est pas une protéine, puisque celle-ci est dénaturée par la chaleur.

Griffith conclut que les bactéries R ont été transformées : le « facteur transformant » a été transmis des bactéries S mortes aux bactéries R vivantes. Il nomme ce phénomène « transformation bactérienne ».

Problème : quel est la nature de ce « facteur transformant » ?

Pour information : les bactéries R et S diffèrent par un allèle du gène codant l’enzyme responsable de la synthèse de la capsule ; l’allèle de la bactérie R porte donc une mutation. Ainsi deux hypothèses sont-elles envisageables pour expliquer cette transformation :

  • une mutation reverse chez la bactérie R. Cependant, la fréquence d’apparition de ce type de mutation est de 10-8, alors que celle de la transformation est de 10-3, ce qui exclut cette hypothèse ;
  • les bactéries S ont « récupéré » le gène codant l’enzyme responsable de la synthèse de la capsule polysaccharidique, ce qui leur confère la propriété de fabriquer cette capsule qui les protège du système immunitaire.
Pleins feux sur l’ADN

Ce n’est que seize ans plus tard, en 1944, que l’Américain Oswald Avery (1877-1955) et ses collaborateurs, Maclyn McCarthy (1911-2005) et Colin MacLeod (1909-1972), apportent la réponse à ce problème : l’agent transformant est l’acide désoxyribonucléique (ADN). Ils mènent de nombreuses expériences afin de purifier le « facteur transformant » des pneumocoques de Griffith (remarque : en 1924, Robert Feulgen – 1884-1955 – met au point le test dit de Feulgen, qui permet de colorer spécifiquement l’ADN et de montrer que les chromosomes en sont constitués).

Avery et ses collaborateurs réalisent des analyses très minutieuses de manière à éviter toute contamination du milieu et ainsi garantir la fiabilité de leurs résultats, ce qui leur permet de publier des analyses indiscutables. Rien n’est laissé au hasard et l’absence de protéines est mise en évidence dans les extraits d’ADN par l’utilisation de réactifs chimiques ou par spectrophotométrie. Ainsi Avery et ses collaborateurs sont-ils assurés que le principe transformant est l’ADN et non une protéine, comme beaucoup de scientifiques le suggéraient à l’époque. En effet, cette molécule, mieux connue que les acides nucléiques, était pressentie comme la molécule support de l’information génétique, alors que la structure de l’ADN n’ayant pas encore été découverte, sa possibilité de codage était inconnue. L’ADN était alors considéré comme une molécule bien trop simple pour jouer le rôle fondamental qu’on lui connaît aujourd’hui.

Dans ces expériences, l’injection à une souris n’est pas forcément nécessaire, puisque les transformations sont alors réalisées in vitro. On considère que la transformation a eu lieu lorsque des bactéries S vivantes sont récupérées alors qu’elles étaient absentes au départ et que seules des bactéries R vivantes avaient été observées.

Les constituants des bactéries étant déjà connus à l’époque d’Avery et de ses collaborateurs, ces derniers pouvaient ainsi en obtenir plus facilement des extraits purifiés.

Expérience 1
Les extraits acellulaires de souches S conduisent, comme les souches S mortes, à l’apparition de bactéries S vivantes. Nous en déduisons que l’extrait acellulaire est capable de transformer les bactéries R et que le « facteur transformant » est une molécule, puisqu’il est présent dans un extrait acellulaire. Cela signifie que l’intégrité de la cellule n’est pas nécessaire à la réalisation de la transformation.

Expérience 2
Un extrait d’ADN seul suffit à l’obtention de bactéries transformées : l’ADN correspond donc au facteur transformant.

Expérience 3
Les extraits ayant subi l’action des ARNases ou des protéases, c’est-à-dire les extraits qui sont dépourvus d’ARN ou de protéines, n’empêchent pas la transformation bactérienne. Le « facteur transformant » ne correspond donc ni à des protéines ni à des ARN. Nous constatons que l’extrait ayant subi l’action des ADNases ne permet plus d’obtenir des bactéries transformées et que le facteur transformant a été détruit. Par conséquent, l’ADN est le « facteur transformant ».

Malgré ces résultats probants, la communauté scientifique recevra froidement les conclusions d’Avery, MacLeod et MacCarthy, continuant à penser que ce sont les protéines qui portent l’information génétique et qu’une molécule décrite comme un polymère de quatre constituants ne rivalise pas avec la diversité des protéines, et ce, malgré l’hypothèse émise en 1884 – au début de la découverte de la molécule d’ADN – par Otto Hertwig, qui travaillait sur le comportement des chromosomes au cours de la fécondation : « Je crois avoir établi qu’il est au moins probable que la nucléine [nom donné à l’ADN, à cette époque] est la substance responsable non seulement de la fécondation, mais aussi de la transmission des caractères héréditaires. »

Problème : comment une molécule aussi simple peut-elle être porteuse d’une information génétique aussi complexe ?

Nous savons aujourd’hui que les bactéries R sont transformées en bactéries S par incorporation au sein de leur génome d’un fragment d’ADN issu des bactéries S porteuses du gène codant l’enzyme responsable de la synthèse de la capsule polysaccharidique. Cette intégration se fait par appariement homologue.

Expériences de Chargaff
Erwin Chargaff (1905-1992), biochimiste américain d’origine autrichienne, fait partie des scientifiques qui prennent conscience de l’importance des travaux d’Avery et de ses collaborateurs. Les progrès techniques étant également importants à cette époque, il peut alors analyser la composition de l’ADN par chromatographie. Voici les résultats de ses expériences, menées en 1950 :

Analyse chimique de différents échantillons d’ADN (pourcentage de nucléotides)

Organismes dont est extrait l’ADN étudié

T

G

A

C

Homme

29,4

19,9

30,9

19,8

Taureau

27,3

22,7

27,9

22,1

Poule

29,2

20,5

28,8

21,5

Sauterelle

29,3

20,5

29,3

20,7

Oursin

32,1

17,7

32,8

17,3

Blé

27,1

22,7

27,3

22,8

Levure

32,9

18,7

31,3

17,1

Bactérie Escherichia coli

23,6

26,0

24,7

25,7

Virus (phage T7)

26,0

24,0

26,0

24,0

L’étude des pourcentages des différentes bases montre que la molécule d’ADN est formée de quatre sortes de constituants : les nucléotides A, C, T, G.

A + T + C + G = 100 %, quel que soit l’organisme. Par conséquent, l’ADN n’est constitué que de nucléotides, le nucléotide étant l’unité élémentaire de l’ADN.

Au sein d’une espèce, il y a toujours autant de A que de T et autant de C que de G (les rapports A/T et C/G sont égaux à 1). Cependant, la proportion des différentes bases est variable d’une espèce à l’autre. Chaque organisme possède donc sa propre composition d’ADN (diversité de la molécule d’ADN).

En 1950, Chargaff met en évidence le fait que la molécule d’ADN n’est pas une succession monotone de quatre éléments, mais qu’elle peut être capable de porter une information codée. En revanche, il faudra attendre Watson et Crick pour parler d’appariement et pour donner une explication à l’égalité des proportions de A et de T, de C et de G, qui reste au stade de constat important.

Problèmes : l’ADN est-il réellement porteur de l’information génétique ? Qu’en est-il des protéines ? Comment rendre compte des égalités observées ?

Les bactériophages, outils fondamentaux de recherche

Alfred Hershey (1908-997) et Martha Chase (1927-2003) sont deux scientifiques américains qui étudient le comportement des bactériophages, virus infectant les bactéries. Lors de ses travaux, Hershey a déjà obtenu des résultats tels que la possibilité de mutations repérables par des variations de la forme des plages de lyse (en 1946) et la mise en évidence de recombinaison chez les phages.

Après les observations d’Avery et de ses collaborateurs, les travaux se multipliant, la communauté scientifique admet l’existence de chromosomes bactériens. Ces organismes, qui ne sont plus considérés comme des organismes particuliers, suscitent de l’intérêt pour les études génétiques. Il est également admis que les virus sont porteurs d’une information génétique.

Pour répondre à la question : « Qui, de l’ADN ou des protéines, est porteur de l’information génétique ? », les virus tels que les bactériophages sont un matériau idéal, puisqu’ils ne sont constitués que d’ADN et de protéines.

En 1952, Hershey et Chase vont utiliser des isotopes radioactifs (c’est le début de cette utilisation en biologie moléculaire) afin de marquer les différents constituants des bactériophages T2 : du P* pour l’ADN ou du S* pour les protéines de la capside (puisque l’ADN est dépourvue de S et que les protéines ne contiennent quasiment jamais de P). Ils infectent des bactéries avec ces phages, puis séparent par centrifugation les capsides vides – fixées à l’extérieur des cellules bactériennes – de la fraction cytoplasmique contenant l’ADN du phage injecté dans le cytoplasme des bactéries, lors de l’infection.

Ainsi Hershey et Chase cherchent-ils à déterminer quelle molécule phagique, ADN ou protéines, est transmise du phage à la bactérie au cours de l’infection.

Expériences 1 et 2
Le surnageant obtenu contient les capsides des phages, alors que le précipité contient des bactéries infectées. La mesure de la radioactivité montre que, lorsque le soufre radioactif est utilisé, la radioactivité n’est présente que dans le surnageant ; lorsque c’est le phosphore radioactif, elle n’est décelable que dans la fraction bactérienne (le culot).

Ainsi les protéines du phage sont-elles restées en dehors de la bactérie. Elles constituent la capside du phage et ne pénètrent pas dans la cellule hôte. En revanche, l’ADN du phage pénètre dans la bactérie. L’ADN étant la seule molécule pénétrant dans la cellule hôte, c’est donc elle qui véhicule l’information génétique.

Par ailleurs, sachant que les bactéries récupérées au niveau du culot de centrifugation, donc débarrassées des phages accrochés à sa surface, sont capables, lorsqu’elles sont remises en culture, de redonner des phages complets, nous en déduisons que l’ADN injecté par le phage lors de l’infection est à l’origine de la production de protéines et d’ADN phagiques par la bactérie hôte. Ainsi de nouveaux phages sont-ils produits et libérés. L’ADN est donc bien le support de l’information génétique et non les protéines.

Problème : quelle est la structure de cette molécule porteuse de l’information génétique ?

Des photographies révélatrices

Rosalind Franklin (1920-1958), grande scientifique anglaise diplômée en chimie physique, a étudié en France la technique de diffraction des rayons X et celle de la cristallographie des rayons X, qu’elle utilisera, de retour en Angleterre, sur la molécule d’ADN (doc d1) pour tenter d’en déterminer la structure. Ce sont ses clichés qui sont à l’origine de la découverte de la structure de l’ADN par le biochimiste et généticien américain James Watson et le physicien anglais Francis Crick (1916-2004), même si ces derniers ne lui ont pas attribué les mérites qui lui revenaient lors de la remise de leur prix Nobel, en 1962, quatre ans après sa mort.

Au début des années 1950, la composition chimique de l’ADN est connue, les résultats des expériences précédentes également, et la détermination de la taille de la molécule d’ADN a conduit à l’hypothèse que celle-ci est constituée de deux chaînes. Par ailleurs, sur la photographie de Rosalind Franklin, Watson et Crick ont pu reconnaître la structure en croix qui caractérise les molécules en hélice. Ils en déduisent que c’est une hélice dont le diamètre est uniforme.

En travaillant sur l’ensemble de ces informations disponibles, Watson et Crick construisent le modèle de la structure de l’ADN, permettant ainsi de rendre compte de toutes les données scientifiques connues (doc D2). Comme chaque fois, la démarche scientifique est appliquée par les deux chercheurs, et ce n’est qu’après plusieurs hypothèses invalidées qu’ils peuvent proposer ce modèle moléculaire de l’ADN, mondialement connu. Celui-ci montre que l’ADN est une macromolécule, formée de deux chaînes complémentaires enroulées en double hélice. Chaque chaîne est constituée d’une succession d’éléments de base : les nucléotides.

Il existe quatre types de nucléotides : A, C, T et G, chacun étant constitué d’un sucre, d’un groupement phosphate et d’une base azotée.

Schéma d’un nucléotide

Schéma d’un nucléotide

Les nucléotides des deux brins d’une molécule d’ADN sont complémentaires : un nucléotide G d’une chaîne est toujours associé à un nucléotide C sur l’autre chaîne. De même, un nucléotide A est toujours positionné en face d’un nucléotide T. Cela explique le fait que, dans toute molécule d’ADN, il y ait autant de A que de T et autant de C que de G (règles de Chargaff).

Les nucléotides complémentaires sont reliés entre eux par des liaisons hydrogènes (liaisons faibles, non covalentes), et les deux chaînes sont disposées de manière antiparallèle l’une par rapport à l’autre (orientation opposée). Le squelette désoxyribose - groupement phosphate constitue l’extérieur de la molécule, alors que les bases sont situées à l’intérieur.

L’ADN est donc le support de l’information génétique.

Problème : comment l’information est-elle codée au sein de la molécule d’ADN ?

Par ailleurs, Watson et Crick ouvrent la voie vers la réplication de l’ADN en écrivant : « Il n’a pas échappé à notre attention que l’appariement spécifique des bases que nous avons proposé suggère immédiatement un mécanisme possible de réplication pour le matériel génétique. »